本发明公开了一种植物耐逆性相关蛋白TaNF-YA1及其编码基因与应用。所述蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与如下至少一种植物耐逆性相关的由(a)衍生的蛋白质：耐旱性和耐盐性。实验证明，将本发明所提供的蛋白TaNF-YA1的编码基因分别导入拟南芥和小麦中，可明显提高拟南芥和小麦的耐旱性和耐盐性。本发明所提供的TaNF-YA1蛋白及其编码基因在提高植物抗逆性方面具有重要意义。
1.一种蛋白质，是由序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白质的编码基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述蛋白质的编码基因为如下1)或2)的基因：1)其核苷酸序列是序列表序列2的第54位至第950位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表序列2所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为YEP-GAP-TaNF-YA1、pBI121-TaNF-YA1、pAHC25-TaNF-YA1和163hGFP-TaNF-YA1；所述YEP-GAP-TaNF-YA1为将权利要求2或3所述的基因插入载体YEP-GAP得到表达权利要求1所述蛋白的重组表达载体；具体为将序列表序列2的第54位至第950位核苷酸所示的DNA分子插入载体YEP-GAP的BamHI和XhoI酶切识别位点之间得到的重组表达载体；所述pBI121-TaNF-YA1为将权利要求2或3所述的基因插入载体pBI121得到表达权利要求1所述蛋白的重组表达载体；具体为将序列表序列2的第54位至第950位核苷酸所示的DNA分子插入载体pBI121的XbaⅠ和SacI酶切识别位点之间得到的重组表达载体；所述pAHC25-TaNF-YA1为将权利要求2或3所述的基因插入载体pAHC25得到表达权利要求1所述蛋白的重组表达载体；具体为将序列表序列2的第54位至第950位核苷酸所示的DNA分子插入载体pAHC25的SmaⅠ和SacI酶切识别位点之间得到的重组表达载体；所述163hGFP-TaNF-YA1为将权利要求2或3所述的基因插入载体hGFP得到表达权利要求1所述蛋白的重组表达载体；具体为将序列表序列2的第54位至第947位核苷酸所示的DNA分子插入载体hGFP的SalI和BamHΙ酶切识别位点之间得到的重组表达载体。
6.含有权利要求2或3所述基因的表达盒。
7.含有权利要求2或3所述基因的重组菌。
8.含有权利要求2或3所述基因的重组病毒。
9.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物；所述目的植物为拟南芥或小麦；所述耐逆性为耐旱性和耐盐性。
10.权利要求1所述蛋白在作为转录因子中的应用。技术领域
本发明涉及生物技术领域中的一种逆性相关的蛋白及其编码基因和应用，特别是一种植物耐逆性相关蛋白TaNF-YA1及其编码基因与应用，该蛋白质TaNF-YA1来源于小麦，具有提高植物抗盐和抗旱胁迫的能力。
背景技术
干旱、高盐及低温等逆境胁迫是影响植物生长发育的障碍因子。因此，了解小麦对逆境条件的应答与信号传导机制，提高小麦品种的抗逆性，成为小麦遗传研究及小麦品种改良的重要任务之一。在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，并伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，探索用生物技术来改进植物生长特性，其目的是提高植物对逆境的适应能力。在干旱、高盐和低温等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害，增强对胁迫环境的抗性。与胁迫相关的基因产物可以分为两大类：第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋白、渗透调节因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等)合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物；第二类基因编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子，如蛋白激酶、转录因子等。其中，转录因子在植物胁迫应答的基因表达调控中起着重要作用。转录因子也称为反式作用因子，是能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用，激活或抑制转录。转录因子的DNA结合区决定了它与顺式作用元件结合的特异性，而转录调控区决定了它对基因表达起激活或是抑制作用。此外，其自身活性还受到核定位及寡聚化等作用的影响。目前已知在植物中与胁迫相关的转录因子主要有：具有AP2结构域的AP2(APETALA2)/EREBP(乙烯应答元件结合蛋白，ethylenexa0responsivexa0elementxa0bindingxa0protein)转录因子家族、含有碱性区域和亮氨酸拉链的bZIP(basicxa0region/leucinexa0zipperxa0motifxa0transcriptionxa0factors)类转录因子、含有保守的WRKY氨基酸序列的WRKY转录因子家族、结合CCAAT-box的主要核转录因子的CBF(CCAATxa0bindingxa0factor)类转录因子、含有碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)和亮氨酸拉链的MYC家族和具有色氨酸簇(Trpxa0cluster)的MYB家族。这些转录因子家族，除WRKY家族不参与植物的水胁迫反应外，其它四个家族均参与调节植物对干旱、高盐和低温等的逆境胁迫反应。其中，NF-Y转录因子在高等植物中广泛存在，近年来，在拟南芥、玉米、水稻均有报道，这表明NF-Y转录因子在高等植物中普遍存在并具有重要作用。NF-Y(核转录因子，Nuclearxa0Factorxa0Y)是一种结合CCAAT-box的主要的核转录因子，特异的识别并结合许多真核生物组成型、诱导性和细胞周期依赖性基因的启动子或增强子中的保守序列CCAAT-box，并调控这些基因的转录水平的表达。NF-Y是由NF-YA、NF-YB和NF-YC三个不同亚基组成的三聚体。NF-YB和NF-YC的组蛋白折叠基序(HFM)相互作用使之形成二聚体，然后结合NF-YA形成异源三聚体的NF-Y复合物，从而结合CCAAT-box，调节其靶基因的转录。NF-YA至少有两个结构域用于蛋白质的结合：富含谷氨酰胺的结构域(Q-richxa0domain)和一个亚基相互作用的结构域(subunitxa0interactionxa0domain)。NF-YB也有两个蛋白结合的结构域：组蛋白折叠基序(histone-foldxa0motif)和TATA结合蛋白(TATA-bindingxa0protein)结合结构域(TBP-bindingxa0domain)。NF-YC有三个蛋白质的结合结构域：组蛋白折叠基序，TBP结合结构域以及富含谷氨酰胺的结构域。NF-YA和NF-YC的结构氨基酸序列与组蛋白折叠基序同源，NF-YB与H2B组蛋白折叠基序相关，而NF-YC于H2A组蛋白折叠基序相关，该基序由三个α螺旋和两个环组成，负责H2A/H2B二聚体的形成。目前，在植物中关于NF-Y转录因子的功能的报道较少，都在干旱胁迫中起重要的作用。Nelson等认为，与拟南芥AtNF-YB1转录因子同源的ZmNF-YB2，在缺水的条件下过表达ZmNF-YB2的转基因玉米可以明显增强抗旱性，由于ZmNF-YB2可以是多个与植物干旱有关参数发生改变，包括叶绿素含量、气口导度、叶片温度、减少萎蔫和维持光合作用，从而提高抗旱性。Wen-Xuexa0Li和Youkoxa00ono等的研究证实，AtNF-YA5的表达受到干旱和ABA处理的诱导。对其启动子GUS分析表明部分诱导反应发生在转录水平。NF-YA5有一个靶位点miR169，在干旱条件下，miR169表达受到抑制。NF-YA5在微管组织和保卫细胞有很高的表达，因此，利用一个关键性转录因子促进多个功能基因的表达，从而增强植物的抗逆性，已经成为植物抗逆基因工程的研究热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物耐逆性相关蛋白TaNF-YA1及其编码基因与应用。本发明所提供的与植物耐逆性相关蛋白，来源于小麦，名称为TaNF-YA1，该蛋白质是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与如下至少一种植物耐逆性相关的由(a)衍生的蛋白质：耐旱性和耐盐性。序列表序列1所示的氨基酸序列由298个氨基酸残基组成，自氨基端第183-187位氨基酸残基序列为核定位信号区，自氨基端第210-240位氨基酸残基序列为保守的NF-YA结构域。为了使上述(a)中的蛋白便于纯化，可在由序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1xa0xa0标签的序列xa0xa0标签
xa0xa0残基
xa0xa0序列
xa0xa0Poly-Arg
xa0xa05-6(通常为5个)
xa0xa0RRRRR
xa0xa0Poly-His
xa0xa02-10(通常为6个)
xa0xa0HHHHHH
xa0xa0FLAG
xa0xa08
xa0xa0DYKDDDDK
xa0xa0Strep-tagII
xa0xa08
xa0xa0WSHPQFEK
xa0xa0c-myc
xa0xa010
xa0xa0EQKLISEEDL
上述(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白的编码基因可通过将序列表序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示标签的编码序列得到。编码所述蛋白质的基因也属于本发明的保护范围。编码所述蛋白质的基因可为如下1)或2)或3)或4)的基因：1)其核苷酸序列是序列表序列2的第54位至第950位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表序列2所示的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述蛋白质的DNA分子；4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。序列表序列2由1010个脱氧核苷酸组成，是小麦TaNF-YA1蛋白的编码基因，其开放阅读框架为自序列表序列2的5’端第54位至950位核苷酸。所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5Mxa0Na₃PO₄和1mMxa0EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5Mxa0Na₃PO₄和1mMxa0EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5Mxa0Na₃PO₄和1mMxa0EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5Mxa0Na₃PO₄和1mMxa0EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5Mxa0Na₃PO₄和1mMxa0EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。含有所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒也属于本发明的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子(如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin))、组成型启动子或组织特异表达启动子(如种子特异表达的启动子)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。含有所述基因的重组载体具体可为YEP-GAP-TaNF-YA1、pBI121-TaNF-YA1、pAHC25-TaNF-YA1或163hGFP-TaNF-YA1；所述YEP-GAP-TaNF-YA1为将所述基因插入载体YEP-GAP得到表达所述蛋白的重组表达载体；具体可为将序列表序列2的第54位至第950位核苷酸所示的DNA分子插入载体YEP-GAP的BamHI和XhoI酶切识别位点之间得到的重组表达载体；所述pBI121-TaNF-YA1为将所述基因插入载体pBI121得到表达所述蛋白的重组表达载体；具体可为将序列表序列2的第54位至第950位核苷酸所示的DNA分子插入载体pBI121的XbaI和SacI酶切识别位点之间得到的重组表达载体；所述pAHC25-TaNF-YA1为将所述基因插入载体pAHC25得到表达所述蛋白的重组表达载体；具体可为将序列表序列2的第54位至第950位核苷酸所示的DNA分子插入载体pAHC25的SmaI和SacI酶切识别位点之间得到的重组表达载体；所述163hGFP-TaNF-YA1为将所述基因插入载体hGFP得到表达所述蛋白的重组表达载体；具体可为将序列表序列2的第54位至第947位核苷酸所示的DNA分子插入载体hGFP的SalI和BamHI酶切识别位点之间得到的重组表达载体。本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。本发明所述的培育转基因植物的方法是将所述基因导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。在上述方法中，所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。在上述方法中，所述双子叶植物具体可为拟南芥；所述单子叶植物具体可为小麦。在上述方法中，所述耐逆性为耐旱性和耐盐性。本发明保护所述蛋白在作为转录因子中的应用。实验证明：将含有序列表序列2的第54位至第950位所示DNA分子的重组表达载体pBI121-TaNF-YA1转化拟南芥得到的T₃代转基因植株，与相同条件下的野生型和转空载体植株相比，在耐旱性实验中(即正常生长萌发15天的幼苗不浇水，直至野生型植株枯萎时，再复水一周)存活率从20％提高到70％；在耐盐性实验中(将正常生长萌发15天的幼苗浇300mmol/L的NaCl水溶液，直至野生型植株枯萎时，再复水一周)存活率从40％提高到84％。将含有序列表序列2的第54位至第950位所示DNA分子的线性片段TaNF-YA1导入小麦得到的T₃代转基因种子，与相同条件下的野生型和转空基因对照植株相比，在8％PEG6000水溶液条件下的发芽率从63-67％提高到83％，在100mmol/Lxa0NaCl水溶液条件下的发芽率从55-56％提高到78％。本发明所提供的TaNF-YA1蛋白及其编码基因在提高植物抗逆性方面具有重要意义，为人为控制抗逆相关基因的表达提供了基础，将在培育高抗逆性如强耐旱性和强耐盐性植物品种中发挥重要作用。
附图说明
图1为实时荧光定量PCR分析不同胁迫处理下TaNF-YA1基因的表达图谱。其中，A为干旱处理，B为高盐处理，C为高温处理，D为脱落酸(ABA)处理；横坐标为处理的时间(小时)，纵坐标为TaNF-YA1基因的相对表达量。图2为TaNF-YA1在洋葱表皮细胞中的定位结果。其中，A为激发光下的观察结果，B为明视场观察结果；C为两种重叠视场下观察的结果。图3为酵母单杂交系统证明转录因子体内结合特异性和激活特性的原理示意图。图4为重组载体pBI121-TaNF-YA1的结构示意图。图5为T3代转基因拟南芥植株的PCR扩增检测电泳图。其中，A为DNA水平检测T3代转TaNF-YA1基因的拟南芥植株，B为cDNA水平检测T₃代转TaNF-YA1基因的拟南芥植株，C为DNA水平检测T₃代转空载体对照拟南芥植株；泳道M代表分子量标准，从上到下的条带依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，泳道C0代表哥伦比亚生态型拟南芥Col-0植株，泳道1-12分别为待鉴定植株，具有预期条带的为转基因拟南芥植株。图6为野生型和转TaNF-YA1基因拟南芥的抗旱性比较。其中，A为干旱处理前的野生型拟南芥植株；B为复水一周后的野生型拟南芥植株；C为干旱处理前的转TaNF-YA1基因的拟南芥植株；D为复水一周后的转TaNF-YA1基因的拟南芥植株。图7为野生型和转TaNF-YA1基因拟南芥的抗盐性比较。其中，A为NaCl处理前的野生型拟南芥植株；B为复水一周后的野生型拟南芥植株；C为NaCl处理前的转TaNF-YA1基因拟南芥植株；D为复水一周后的转TaNF-YA1基因拟南芥植株。图8为重组表达载体pAHC25-TaNF-YA1的质粒图谱。图9为T₀代转基因小麦植株的基因组PCR扩增检测电泳图。其中，图A为T₀代转TaNF-YA1基因的小麦植株，泳道M代表分子量标准，从上到下的条带依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，泳道P代表以质粒pAHC25-TaNF-YA1阳性对照，泳道0代表以非转基因石麦4185阴性对照，泳道1-10分别为待鉴定植株，具有预期条带的为转TaNF-YA1基因小麦植株；图B为T₀代转空基因的小麦植株；泳道M代表分子量标准，从上到下的条带依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，泳道P代表以质粒pAHC25阳性对照，泳道0代表以非转基因石麦4185阴性对照，泳道1-9分别为待鉴定植株，具有预期条带的为转空基因小麦植株。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用的小白麦、石麦4185、载体hGFP、YEP-GAP和pAHC20的来源如下：小白麦(Triticumxa0aestivumxa0cv.Xiaobaimai)和载体hGFP：中国农业科学院作物科学研究所保证向公众提供；参考文献Zhao-Shixa0Xu，Lan-Qinxa0Xia，Mingxa0Chen，etxa0al.Isolationxa0andxa0molecularxa0characterizationxa0ofxa0thexa0Triticumxa0aestivumxa0L.ethylene-responsivexa0factorl(TaERF1)thatxa0increasesxa0multiplexa0stressxa0tolerance.Plantxa0Mol.Biol.65：719-732；石麦4185：购自河北省景县望丰种业有限公司；载体YEP-GAP：中国农业科学院作物科学研究所保证向公众提供；参考文献Liuxa0Q，Kasugaxa0M，Sakumaxa0Y，Abexa0H，Miuraxa0S，Yamaguchi-Shinozakixa0K，Shinozakixa0K.Twoxa0transcriptionxa0factors，DREB1xa0andxa0DREB2，withxa0anxa0EREBP/AP2DNAxa0bindingxa0domainxa0separatexa0twoxa0cellularxa0signalxa0transductionxa0pathwaysxa0inxa0drought-andxa0low-temperature-responsivexa0genexa0expression，respectively，inxa0Arabidopsis，Plantxa0Cellxa01998，10(8)：1391-1406；载体pAHC20：中国农业科学院作物科学研究所保证向公众提供；参考文献Shi-Qingxa0Gao，Mingxa0Chen，Zhao-Shixa0Xu，Chang-Pingxa0Zhao，Lianchengxa0Li，Hui-junxa0Xu，Yi-miaoxa0Tang，Xinxa0Zhaoxa0andxa0You-Zhixa0Ma.Thexa0soybeanxa0GmbZIP1xa0transcriptionxa0factorxa0enhancesxa0multiplexa0abioticxa0stressxa0tolerancesxa0inxa0transgenicxa0plants.Plantxa0Molecularxa0Biology，2011，75(6)：537-553。实施例1、TaNF-YA1基因的克隆一、RNA的分离将水培生长10天左右的小白麦三叶期幼苗干旱处理2小时，用液氮速冻，-80℃保存备用。采用RNAxa0prepxa0purexa0Plantxa0Kit(DP432，天根生化科技(北京)有限公司)进行RNA的分离。第一链cDNA合成用反转录酶XL(AMV)(TaKaRa)。采用SMART法合成dscDNA，PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。二、TaNF-YA1基因全长序列的获得通过5’RACE和3’RACE的方法获得小麦CCAAT-box的核转录因子全长cDNA序列(如序列表序列2所示)，将该转录因子的编码基因命名为TaNF-YA1基因，其开放阅读框架为序列表序列2的5’端第54位至950位核苷酸，其翻译的蛋白TaNF-YA1的氨基酸序列如序列表序列1所示，该蛋白由298个氨基酸残基组成，具有保守的富含谷氨酰胺的结构域和一个亚基相互作用的结构域，自氨基端第183-187位氨基酸残基序列为核定位信号区，自氨基端第210-240位氨基酸残基序列为保守的NF-YA结构域。将TaNF-YA1蛋白在Genbank上进行比对，与拟南芥中的AtNF-YA1具有较高同源性，而在小麦中未发现同源蛋白基因，证明TaNF-YA1基因是一个新的基因。实施例2、实时荧光定量PCR分析TaNF-YA1基因的表达特性一、胁迫处理将盆栽的苗龄为10天的小白麦幼苗，进行以下处理：(1)干旱处理：将小白麦幼苗取出吸干根上的水分，置于干燥的滤纸上，干旱培养0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时后取出材料，用液氮速冻，-80℃保存备用。(2)高盐处理：将小白麦幼苗置于200mM的NaCl水溶液中，光照培养0.5小时、1小时、2小时、5小时、12小时、24小时后分别取出材料，用液氮速冻，-80℃保存备用。(3)高温处理：将小白麦幼苗置于42℃下，光照培养0.5小时、1小时、2小时、5小时、12小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。(4)脱落酸(ABA)处理：将小白麦幼苗置于100μM的脱落酸水溶液中，光照培养0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。对照的处理：直接取未经任何处理的小白麦幼苗-80℃冻存作为对照(0小时)。二、总RNA的分离将步骤一获得的材料分别用RNAxa0prepxa0purexa0Plantxa0Kit(DP432，天根生化科技(北京)有限公司)进行RNA的分离。三、反转录为cDNA采用R103-Quant_Reverse_Transcriptase(天根生化科技(北京)有限公司)将步骤二纯化的RNA反转录为cDNA。四、实时荧光定量PCR将cDNA稀释50倍后作为实时荧光定量PCR的模板。用TaNF-YA1基因3’端编码区的特异引物对样品进行实时荧光定量PCR扩增，分析基因对各种处理的应答情况，以actin做内参，引物为actin-2F和actin-2R。实时荧光定量PCR在ABIxa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="164"/>7000实时荧光定量PCR仪上进行，一次平行试验设3次重复。利用Livakxa0KJ和SchmittgenTD(2001)报道的方法，即2^-ΔΔCT计算相对表达量。ΔΔC_T＝(C_T.Target-C_T.Actin)_Timexa0x-(C_T.Target-C_T.Actin)_Timexa00Timexa0x表示任意时间点，Timexa0₀表示经actin校正后1倍量的目标基因表达。TaNF-YA1基因3’端编码区的特异引物：F：5’-GCCATACCTTCATGAATCTCG-3’；R：5’-ACATGTTGGAGGGAGCTGAT-3’actin基因3’端编码区的特异引物：actin-2F：5’-CTCCCTCACAACAACCGC-3’；actin-2R：5’-TACCAGGAACTTCCATACCAAC-3’。结果如图1中的A-D所示，TaNF-YA1对各个胁迫表现出响应。实施例3、TaNF-YA1亚细胞定位分析一、重组表达载体的构建根据序列2的第54位至第947位所示TaNF-YA1基因的序列设计引物TaNF-YA1和TaNF-YA1-XI，引物末端分别引入SalI和BamHI酶切位点，以小白麦的cDNA为模板，PCR扩增获得TaNF-YA1基因。TaNF-YA1：5’-CCTGTCGACATGGAGGATCATCCTGGCCATC-3’；TaNF-YA1-XI：5’-CGTGGATCCCCTCATCATGGAAGCGCGCTGG-3’。PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。回收900bp左右的目的产物，用SalI和BamHI双酶切后，连接到亚细胞定位载体hGFP的SalI和BamHI位点间，热击转化大肠杆菌DH5α。对阳性单克隆进行质粒提取，并用TaNF-YA1和TaNF-YA1-XI进行PCR检测，将阳性克隆进行测序。测序结果表明，得到了重组质粒163hGFP-TaNF-YA1，该重组质粒为在载体hGFP的SalI和BamHI位点间插入了序列表序列2的第54位至第947位所示的DNA分子。二、材料准备：在9cm培养皿上铺一薄层MS培养基，将洋葱表皮撕下后内表面朝上，平铺于MS培养基中心，直径在3cm范围内，25℃预培养4h。三、金粉的处理：取100mg直径为1.0μM的金粉放入1.5ml离心管中，加入1ml无水乙醇，充分振荡3min，以12000rpm离心1min，去上清，再加入1ml无菌水充分混匀后，以12000rpm离心，重复上述步骤3次。最后，将金粉悬浮于1ml超纯水中，-20℃保存备用。四、制备微粒子弹：3μg重组质粒163hGFP-TaNF-YA1加入直径为1.0μM的金粉悬液6μl(50mg/ml)，0.1M亚精胺(spermidine)4μl，2.5Mxa0CaCl₂xa06μl，将金粉、DNA、亚精胺和氯化钙先分别振荡混匀，然后混合振荡混匀3min后，冰上静置15min。12000rpm离心10s(指转速达到12000rpm后10s)，弃上清。加入140μl无水乙醇，粗振荡后(打散金粉)12000rpm离心10s，收集金粉沉淀。20μl无水乙醇悬浮沉淀，点膜。五、基因枪轰击受体材料：①选用一定压力的可裂膜(本实验用1100psi)，与轰击膜一起，在70％的酒精中浸泡1～2h，取出晾干；②金属挡板用酒精浸泡，在酒精灯上灭菌，基因枪的超净工作台紫外灭菌；③取20μl上述制备好的金粉-质粒复合体，均匀涂布于轰击膜的中间位置上，不要涂于整个膜上，大小与载体固定圈上的孔径范围一致，晾干，然后固定在载体固定圈上；④将上述载体固定圈安装到发射装置上；⑤将可裂膜安装到气体加速管下端；⑥将洋葱表皮培养皿放入真空室内，取下培养皿盖；⑦抽真空指针到26In/Hg；⑧放氦气于气体加速管，直到管中压力达到可裂膜所能承受的压力时，可裂膜破开；⑨气体冲到轰击膜上，载体向下运动，被金属挡板挡住，而下面的金粉-质粒复合体却透过金属挡板的网孔射向靶细胞；⑩将轰击好的洋葱表皮细胞放入25℃培养箱中，暗培养16～24h后在激光共聚焦显微镜下观察。六、洋葱表皮细胞镜检：将基因枪轰击、暗培养16-24h之后的洋葱表皮压片，然后在激光扫描共聚焦显微镜(Bio-Radxa0MicroRadiance)(Laserxa0scanningxa0confocalxa0microscopy，LSMC)观察GFP(绿色荧光蛋白)荧光，并进行扫描照像。LSCM的工作参数为：Ex＝488nm，Em＝525±15nm，Power＝10％，Zoom7，中速扫描，frame512×512。软件为TIME-COURSE和PHOTOSHOP5.0。结果如图2所示，结果表明TaNF-YA1蛋白定位于细胞核中。实施例4、TaNF-YA1的激活特性用酵母单杂交系统证明转录因子的激活特性的主要原理如图3所示，将CCAAT顺式作用元件和突变体CCAAT顺式作用元件分别构建到pHISi-1载体和pLacZi载体的基本启动子Pmin(minimalxa0promoter)上游，Pmin启动子下游连接报道基因(HIS3、LacZ和Ura3)。当连接有编码转录因子的目的基因的表达载体YEP-GAP(不含激活功能)分别转化到连有CCAAT顺式作用元件和突变体CCAAT顺式作用元件的酵母细胞后，如果连有突变体CCAAT顺式作用元件的酵母细胞中的报道基因不能表达，而连有特定的CCAAT顺式作用元件的酵母细胞中的报道基因能够表达，说明该转录因子能与CCAAT顺式作用元件结合，且具有激活功能，激活了Pmin启动子，促使报道基因表达。从而证明了目的转录因子的体内结合特异性和激活功能。YPD液体培养基：细菌培养用酵母抽提物(Bacto-Yeastxa0Extract)10g/L，细菌培养用胰化蛋白胨(Bacto-Peptone)20g/L，调节pH至5.8，121℃/15min灭菌，降至60℃以后加入40％的Glucose，使其终浓度为20g/L。SD/His^-/Ura^-/Trp^-选择性培养基：不含氨基酸的酵母氮源(Yeastxa0nitrogenxa0base)6.7g/L，营养缺陷型混合物(drop-outxa0mediaxa0withoutxa0His/Ura/Trp)100ml，琼脂粉(Bacteriologicalxa0agar)20g/L，调节pH至5.8，121℃/15min灭菌，降至60℃后加入40％Glucose，使其终浓度为20g/L。营养缺陷型混合物(Drop-outxa0mix)：(10×)：L-Isoleucine(异亮氨酸)300mg/L，L-Valine(缬氨酸)1500mg/L，L-Adenine(腺嘌呤)200mg/L，L-Arginine(精氨酸)200mg/L，L-Histidinexa0Hclxa0monohydrate(组氨酸)200mg/L，L-Leucine(亮氨酸)1000mg/L，L-Lysinexa0Hcl(赖氨酸)300mg/L，L-Methionine(甲硫氨酸)200mg/L，L-Phenylalanine(苯丙氨酸)500mg/L，L-Threonine(苏氨酸)2000mg/L，L-Tyrosine(酪氨酸)300mg/L。1×PEG/LiAc：50％PEG3350xa08ml，10×TExa0bufferxa01ml，10×LiAcxa01ml。10×TExa0Buffer：100mMxa0Tris-Hcl，10mMxa0EDTA、pH＝7.5，121℃高压灭菌，室温保存。1×TE/LiAc：10×TExa0bufferxa01ml，10×LiAcxa01ml，ddH₂Oxa08ml。Zxa0Buffer：Na₂HPO₄·7H₂Oxa016.1g/L，NaH₂PO₄·H₂Oxa05.5g/L，KClxa00.75g/L，MgSO₄·7H₂O0.246g/L，调节pH至7.0，121℃/15min灭菌，4℃保存。X-gal储存液(X-galxa0Stockxa0Solution)：用N，N-dimethyl-formamide(DMF)溶解X-gal，使其终浓度为20mg/ml，-20℃贮存。含有X-gal的Zxa0buffer缓冲液100ml(Zxa0bufferxa0withxa0X-gal)，现用现配：Zxa0buffer98ml，β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)0.27ml，X-gal储存液(X-galxa0stockxa0solution)1.67ml。10×LiAc：100mMxa0Tris-Hcl，100mMxa0EDTA，pH＝7.5。121℃高压灭菌、室温保存。一、重组表达载体的构建1、TaNF-YA1基因的获得根据TaNF-YA1基因的序列设计引物TaNF-YA1-BI和TaNF-YA1-XI，引物末端分别引入BamHI和XhoI识别序列，以小白麦的cDNA为模板，PCR扩增TaNF-YA1基因，将PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。TaNF-YA1-BI：5’-TTTGGATCCATGGAGGATCATCCTGGCCATC-3’；TaNF-YA1-XI：5’-GGTCTCGAGTTACCTCATCATGGAAGCGCGCTGG-3’。采用Agarosexa0Gelxa0DNAxa0Purificationxa0Kitxa0Ver.2.0(TaKaRa，DV807A)回收纯化900bp左右的PCR产物。2、重组表达载体的构建①用限制性内切酶BamHI和XhoI酶切步骤1回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；②用限制性内切酶BamHI和XhoI酶切表达载体YEP-GAP，回收载体骨架；③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；④将步骤③的连接产物电击转化JM109菌株(Clontech公司)，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒YEP-GAP-TaNF-YA1，该质粒为在载体YEP-GAP的BamHI和XhoI酶切位点之间插入了序列表序列2自5’端第54位-950位核苷酸所示的DNA片段)。二、TaNF-YA1的体内结合特异性和激活特性的验证1、酵母报道子的构建(1)正常双重酵母报道子的构建DNA片段A(含4个CCAAT元件：TTTAACCAATCAGAAA)：5’-GAATTC-CCAAT-CCAAT-CCAAT-CCAAT-GTCGAC-3’(CCAAT的核心序列：CCAAT)。DNA片段A的核苷酸序列见序列表的序列3。将DNA片段A构建到pHISi-1载体(MATCHMAKERxa0One-Hybridxa0System，Clontech公司)的Pmin_HIS3启动子上游，得到重组载体pHISi-1-CCAAT，用XhoI和NcoI内切酶将pHISi-1-CCAAT载体切成线状。将DNA片段A构建到pLacZi载体(MATCHMAKERxa0One-Hybridxa0System，Clontech公司)P_CYCI启动子上游，得到重组载体pLacZi-CCAAT，用XhoI和NcoI内切酶将pLacZi-CCAAT载体切成线状。先将线状pHis-1-CCAAT载体转化到酵母细胞(YM4271株系，MATCHMAKEROne-Hybridxa0System，Clontech公司)内，获得能在SD/His-培养基上正常生长的酵母转化子。接着以这种酵母转化子为寄主细胞，继续转化含有4个重复CCAAT元件的pLacZi-CCAAT载体。这样在同时缺乏组氨酸和尿嘧啶的SD/His^-/Ura^-培养基上，选择获得含有pHISi-1-CCAAT和pLacZi-CCAAT的正常双重酵母报道子。(2)突变体双重酵母报道子的构建DNA片段B(含4个mCCAAT元件)：5’-GAATTC-mCCAAT-mCCAAT-mCCAAT-mCCAAT-GTCGAC-3’(MDRE：将4个CCAAT元件的核心序列CCAAT突变成TTTTA)。DNA片段B的核苷酸序列见序列表的序列4。用DNA片段B代替DNA片段A，方法同步骤(1)，得到突变体双重酵母报道子。2、PEG/LiAc法转化酵母及结果分析(1)接种酵母菌株(YM4271株系)到1mlxa0YPD液体培养基中，剧烈震荡2分钟，分散团块后将悬浮液转至含有50mlxa0YPD液体培养基的三角瓶中，30℃/250rpm摇过夜，测OD600＝1.7-1.8(计数约4×10⁷个/mL)；(2)取30ml步骤(1)过夜培养物接到300ml新鲜的YPD培养基中，30℃/250rpm培养，约3小时(至OD600＝0.5±0.1)，室温1000g离心5min，收集菌体，弃上清，用1/2体积1×TE悬浮，1000g/5min离心；(3)吸弃上清，用1.5ml新鲜配制的1×TE/LiAc溶液悬浮，振荡混匀备用；(4)取出0.1ml酵母感受态进行转化，依次加下列溶液：0.1μgxa0YEP-GAP-TaNF-YA1、0.1mgxa0ssDNA(鲑鱼精DNA，Sigma)、0.6mlPEG/LiAc高速振荡1分钟，30℃/200rpm振荡培养30分钟；(5)加入70ulxa0DMSO(Sigma，D8779)，轻轻倒置混匀，42℃热激30分钟，其间轻轻振荡，冰浴2分钟，室温1000g离心5min；(6)吸弃上清，加入0.5mlxa01×TExa0buffer悬浮细胞；(7)用接种环蘸取悬浮液，分别在含有0、15mmol/Lxa03-AT的SD/His^-/Ura^-/Trp^-选择性培养基上画线培养。(8)平板的一半培养正常双重酵母报道子，另一半培养突变体双重酵母报道子，以便做对照分析。(9)颠倒放置于培养箱中，30℃培养3-4天。(10)结果发现在Ommol/L3-AT的SD/His^-/Ura^-/Trp^-的培养基平板上正常的酵母报道子和突变的酵母报道子都有生长，但突变的酵母报道子的直径明显小；而在15mmol/L3-AT的SD/His^-/Ura^-/Trp^-的培养基平板上正常的酵母报道子能正常生长，但突变的酵母报道子被抑止没有生长。3、半乳糖苷酶活性检测(1)从0mmol/L3-AT的SD/His^-/Ura^-/Trp^-的培养基平板上分别挑取正常的酵母报道子和突变的酵母报道子菌落。转至YPD液体培养基中，于30℃振荡培养，待长至对数生长后期，取1.5ml菌液，3000rpm离心30s；(2)弃上清，控干管中液体，将离心管置于液氮中速冻10min，取出使其自然融解，加50μlxa0Z/X-gal溶液，30℃温育，结果发现正常的酵母报道子在6-8h内变蓝，而突变的酵母报道子在12h内没有变化，仍为白色。说明转录因子TaNF-YA1能与CCAATxa0顺式作用元件结合，且具有激活功能，激活了P_min启动子，促使报道基因表达。从而证明了TaNF-YA1的体内结合特异性和激活功能。实施例5、TaNF-YA1提高拟南芥的抗旱性与抗盐性一、重组表达载体的构建1、TaNF-YA1基因的克隆根据TaNF-YA1基因的序列设计引物对TaNF-YA1-121F和TaNF-YA1-121R，引物末端分别引入XbaI和SacI酶切识别位点，以小白麦的cDNA为模板PCR扩增TaNF-YA1。将得到的PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，采用Agarosexa0Gelxa0DNAPurificationxa0Kitxa0Ver.2.0(TaKaRa，DV807A)回收纯化900bp左右的目的条带。TaNF-YA1-121F：5’-GCTCTAGAATGGAGGATCATCCTGGCCATC-3’；TaNF-YA1-121R：5’-CGAGCTCTTACCTCATCATGGAAGCGCGCTGG-3’。2、重组表达载体的构建①用限制性内切酶XbaI和SacI酶切步骤1回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；②用限制性内切酶XbaI和SacI酶切pBI121(Clontech公司)，回收载体骨架；③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；④将步骤③的连接产物电击转化TOP10菌株(天根生化科技(北京)有限公司)，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒pBI121-TaNF-YA1(如图4所示，在pBI121的XbaI和SacI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’端第54-950位核苷酸所示的DNA片段)。二、转基因拟南芥的获得1、用重组质粒pBI121-TaNF-YA1电击法转化农杆菌C58C1(北京拜尔迪生物技术公司)，得到重组农杆菌。2、将重组农杆菌接种于LB(含50mg/L利福平，100mg/L卡那霉素，50mg/L庆大霉素)液体培养基中，28℃、3000rpm培养约30小时；3、将步骤2的菌液转至LB(含50mg/L利福平，100mg/L卡那霉素，50mg/L庆大霉素)中，28℃、300rpm培养约14小时(菌液OD600达到1.5-3.0)；4、收集菌体，4℃、4000g离心10min，用含10％蔗糖MS液体培养基(含0.02％silwet)稀释至OD600约为0.8-1.0；5、将拟南芥(哥伦比亚生态型Col-0，SALK公司)整株与花盆一起倒扣在盛有步骤4的菌液的容器中，使花浸泡50s左右，浸泡完毕后，取出花盆，侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，24小时后揭开塑料布，直立放置花盆，进行正常的光照培养，收获T₁代种子，卡那霉素筛选(浓度为50mg/L卡那霉素)抗性植株。T₂代表示T₁代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₃代表示T₂代自交产生的种子及由它所长成的植株。用PCR方法对T₃代抗性植株分别进行DNA和cDNA水平鉴定，部分样本的鉴定结果如图5中的A和B所示，结果与预期相符。从抗性植株中筛选得到阳性转TaNF-YA1基因的拟南芥植株。DNA水平鉴定的PCR引物对：F：5’-ATGGAGGATCATCCTGGCCATC-3’；R：5’-TTACCTCATCATGGAAGCGCGCTGG-3’；预期条带为897bp；cDNA水平鉴定的PCR引物对：F：5’-ATGGAGGATCATCCTGGCCATC-3’；R：5’-TTACCTCATCATGGAAGCGCGCTGG-3’；预期条带为897bp。三、转空载体对照拟南芥的获得用质粒pBI121转化农杆菌，将得到的重组农杆菌转化拟南芥Col-0，得到抗性转空载体对照拟南芥植株，实验方法同步骤二。T₃代抗性转空载体对照拟南芥植株的PCR鉴定引物为引物F和引物R，预测产物为600bp，结果如图5中的C所示。引物F：5’-TTCAGAAAGAATGCTAACCC-3’；引物R：5’-GAGGCATCTTCAACGATGGCCTT-3’。四、转基因拟南芥的耐旱性与耐盐性鉴定1、耐旱性鉴定分别将经PCR鉴定呈阳性的T₃代转基因拟南芥植株(Transgenicxa0Line，TL)、经PCR鉴定呈阳性的T₃代转空载体对照植株(CK)和拟南芥Col-0(WT)(各60株)进行耐旱性鉴定。设置三次重复实验，结果取平均值。将正常生长的萌发15天的幼苗不浇水，直至野生型植株枯萎(不浇水2周时)，然后复水一周，观察表型、拍照并统计存活率，结果如表2和图6所示。表2.转基因拟南芥植株耐旱性鉴定的存活率统计结果
xa0xa0重复1
xa0xa0重复2
xa0xa0重复3
xa0xa0平均
xa0xa0TL
xa0xa068％
xa0xa070％
xa0xa072％
xa0xa070％
xa0xa0CK
xa0xa018％
xa0xa019％
xa0xa020％
xa0xa019％
xa0xa0WT
xa0xa019％
xa0xa020％
xa0xa021％
xa0xa020％
结果表明：拟南芥Col-0的存活率为20％，70％转基因拟南芥植株存活且能正常生长。转空载体对照植株的表型与拟南芥Col-0一致，存活率与拟南芥Col-0没有显著差异。2、耐盐性鉴定分别将经PCR鉴定呈阳性的T₃代转基因拟南芥植株(Transgenicxa0Line，TL)、经PCR鉴定呈阳性的T₃代转空载体对照植株(CK)和拟南芥Col-0(WT)(各60株)进行耐盐性鉴定。设置三次重复实验，结果取平均值。将正常生长的萌发15天的幼苗浇300mmol/L的NaCl水溶液，直至野生型植株枯萎(浇盐水1周)，然后复水一周，观察表型、拍照并统计存活率，结果如表3和图7所示。表3.转基因拟南芥植株耐盐性鉴定的存活率统计结果
xa0xa0重复1
xa0xa0重复2
xa0xa0重复3
xa0xa0平均
xa0xa0TL
xa0xa083％
xa0xa084％
xa0xa085％
xa0xa084％
xa0xa0CK
xa0xa038％
xa0xa040％
xa0xa042％
xa0xa040％
xa0xa0WT
xa0xa039％
xa0xa040％
xa0xa041％
xa0xa040％
结果表明：拟南芥Col-0的存活率为40％，84％转基因植株存活且能正常生长。转空载体对照植株的表型与拟南芥Col-0一致，存活率与拟南芥Col-0没有显著差异。实施例6、TaNF-YA1提高小麦的抗旱性与抗盐性一、重组表达载体的构建1、TaNF-YA1基因的获得根据TaNF-YA1基因的序列设计引物对(TaNFYAF和TaNFYAR)，引物末端分别引入SmaI和SacI酶切位点，以小白麦的cDNA为模板，PCR扩增TaNF-YA1基因。引物TaNFYAF：5’-TTTCCCGGGATGGAGGATCATCCTGGCCATC-3’；引物TaNFYAR：5’-GGTGAGCTCTTACCTCATCATGGAAGCGCGCTGG-3’。PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。采用Agarosexa0Gelxa0DNAxa0Purificationxa0Kitxa0Ver.2.0(TaKaRa，DV807A)回收纯化900左右的PCR产物。2、重组表达载体的构建①用限制性内切酶SmaI和SacI酶切步骤1回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；②用限制性内切酶SmaI和SacI酶切pAHC25(北京拜尔迪生物技术公司)，回收载体骨架；③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；④将步骤③的连接产物电击转化TOP10菌株(天根生化科技(北京)有限公司)，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒pAHC25-TaNF-YA1(如图8所示，在pAHC25的SmaI和SacI酶切位点之间插入了序列表序列2自5’端第54位-950位核苷酸所示的DNA片段)。二、线性片段TaNF-YA1转基因小麦的获得1、基因枪法转化小麦愈伤组织取石麦4185授粉后14天的未成熟胚，接种于SD2培养基上，26℃黑暗条件下诱导愈伤组织，7-10d后准备基因枪轰击。以质粒pAHC25-TaNF-YA1为模板，以X2503PF和X2503TR为引物进行PCR扩增，1.2％琼脂糖凝胶电泳后，用Agarosexa0Gelxa0DNAxa0Purificationxa0Kitxa0Ver.2.0(TaKaRa，DV807A)回收纯化3121bp左右的PCR产物。经测序验证，该3121bp左右的PCR产物由pAHC25-TaNF-YA1上完整的Ubi启动子序列1917bp、TaNF-YA1基因的开放阅读框序列897bp(即序列表序列2中的第54位至第950位的序列)和pAHC25-TaNF-YA1上的NOS终止子序列307bp组成，将该3121bp的片段命名为线性片段TaNF-YA1。X2503PF：5’-TGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACAAGCTTGCATGCCTGCAGTGCA-3’；X2503TR：5’-GTTTACCCGCCAATATATCTGTCACGAATTCCCCGATCTAGTAACATAGATGACACC-3’取适量金粉(1.0μm)悬浮液(60μg/枪)，将金粉和以重组表达载体pAHC25-TaNF-YB1为模板扩增的上述线性片段TaNF-YA1以及携带有BAR抗性基因的质粒pAHC20的混合液在4℃振荡10min，14000rpm离心5min去上清，加入无水乙醇(10μl/枪加乙醇)准备用于基因枪轰击。取适量金粉(1.0μm)悬浮液(60μg/枪)，在4℃振荡10min，14000rpm离心5min去上清，加入无水乙醇(10μl/枪加乙醇)准备用于基因枪轰击。采用PDS-1000/He基因枪(Bio-Rad公司生产)轰击小麦幼胚诱导的愈伤组织。选择1100Psi的可裂膜，对愈伤组织进行轰击。轰击后的愈伤组织继续在原渗透压培养基(Clontech)上培养16-18h，然后转入不加筛选剂的SD2培养基(Clontech)中26℃黑暗条件下恢复培养2周。2周后，将愈伤组织转入第一次筛选培养基上(1/2MS+玉米素0.5mg/L+2％蔗糖+双丙氨膦钠3mg/L；或1/2MS+a-萘乙酸1mg/L+6-糠氨基嘌呤0.5mg/L+2％蔗糖+双丙氨膦钠3mg/L也可)在24℃每天光照10h条件下筛选分化培养4周。当愈伤组织分化出绿芽以后，将分化的绿芽再转入无激素培养基(1/2MS+双丙氨膦钠4mg/L)上24℃每天光照10h条件下培养4周左右，当小苗伸长到1-2cm时，将抗双丙氨膦钠的再生植株移入壮苗培养基(1/2MS+生长素0.5mg/L+多效唑0.5mg/L)上壮苗，再生植株生长到苗高6-8cm、根系较好时移入营养钵中，在15℃左右光照培养，待苗壮后置于温室，最后共获得T₀代抗性小麦转化苗84株。2、转基因小麦的PCR鉴定将步骤1得到的T₀代抗性小麦转化苗进行DNA分子水平的PCR鉴定，引物为5’-TGCTGCAACAAACTCTCGTGTGCC-3’和5’-TTACCTCATCATGGAAGCGC-3’，预测产物大小502bp，部分电泳结果如图9A所示，共得到84个T₀代转TaNF-YA1基因的小麦植株。T₁代表示T₀代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₂代表示T₁代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₃代表示T₂代自交产生的种子及由它所长成的植株。三、转空基因对照小麦的获得将对照线性片段Ubi0NOS和pAHC20按照步骤二的方法同时转化石麦4185，获得转空基因对照小麦植株。上述对照线性片段Ubi0NOS的制备方法如下：以质粒pAHC25为模板，以上述引物X2503PF和X2503TR进行PCR扩增，得到2224bp的对照线性片段Ubi0NOS(由pAHC25-TaNF-YA1上的完整的Ubi启动子序列1917bp和pAHC25-TaNF-YA1上的NOS终止子序列307bp组成)。转空基因对照小麦植株PCR鉴定的引物为5’-GCGGTCGTTCATTCGTTCTA-3’和5’-TATTGCCAAATGTTTGAACGAT-3’，靶基因为Ubi启动子，预测产物大小250bp。经PCR鉴定，T₀代共获得8株阳性转空基因对照小麦植株，结果如图9B所示。四、转基因小麦的耐旱性与耐盐性鉴定2011年10月将经PCR鉴定呈阳性的转TaNF-YA1基因小麦T₂代植株(TL2)和PCR鉴定呈阳性的转空基因对照小麦T₂代植株(CK2)以及石麦4185(WT2)3种植株各37株种植于大田，2012年2月移栽于温室，单株收获T₃代种子，将经过PCR及基因分离实验验证为纯合转基因T₂代植株所结的T₃代种子进行如下的耐旱与耐盐萌发鉴定实验：1、耐旱萌发鉴定方法：取饱满种子，用0.5％的次氯酸钠溶液进行表面消毒后，无菌水洗3遍，置于发芽盒内，盒内垫有两层无菌滤纸，并用8％PEG6000水溶液浸润，每个实验中每种植株的种子做3次重复，每个重复50粒种子，25℃放置7天后，统计各重复发芽率：如表4所示。转TaNF-YA1基因的小麦(TL2)在8％PEG模拟抗旱的条件下有83％的种子正常发芽；而转空基因对照小麦(CK2)的发芽率为67％，与石麦4185(WT2)没有显著差异。表4.转基因小麦植株耐旱性鉴定的发芽率统计结果
xa0xa0重复1
xa0xa0重复2
xa0xa0重复3
xa0xa0平均
xa0xa0TL2
xa0xa081％
xa0xa085％
xa0xa083％
xa0xa083％
xa0xa0CK2
xa0xa068％
xa0xa070％
xa0xa063％
xa0xa067％
xa0xa0WT2
xa0xa062％
xa0xa064％
xa0xa060％
xa0xa063％
2、耐盐萌发鉴定方法：与步骤1相同，将8％PEG6000水溶液换为100mmol/Lxa0NaCl水溶液。结果：如表5所示。在100mmol/Lxa0NaCl水溶液模拟高盐环境的条件下，转TaNF-YA1基因的小麦(TL2)有78％的种子正常发芽；而转空基因对照小麦(CK2)的发芽率仅为56％，与石麦4185(WT2)没有显著差异。表5.转基因小麦植株耐盐性鉴定的发芽率统计结果
xa0xa0重复1
xa0xa0重复2
xa0xa0重复3
xa0xa0平均
xa0xa0TL2
xa0xa076％
xa0xa080％
xa0xa078％
xa0xa078％
xa0xa0CK2
xa0xa056％
xa0xa058％
xa0xa054％
xa0xa056％
xa0xa0WT2
xa0xa054％
xa0xa055％
xa0xa056％
xa0xa055％
上述结果表明，与转空基因对照小麦和石麦4185相比，转TaNF-YA1基因的小麦在耐旱和耐盐方面的能力得到了明显提高。ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="461"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="462"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="451"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>